Nel 1535 si aprì una nuova fase del conflitto tra Carlo V e Francesco I. La causa scatenante delle rinnovate ostilità fu la rottura dell'equilibrio concordato a Bologna, provocata dalla morte, avvenuta nel novembre dello stesso anno, di Francesco II Sforza, l'ultimo della dinastia degli Sforza, che era stato reintegrato come duca di Milano. Alla notizia della sua morte, l'imperatore Carlo V prese possesso diretto del Ducato, essendo un feudo imperiale, senza incontrare resistenze né tra la popolazione milanese né tra gli altri Stati italiani. Tuttavia, dalla Francia, Francesco I sollevò obiezioni, considerando Milano, insieme a Genova e Asti, come suoi possedimenti. Deciso a rompere l'accerchiamento asburgico, Francesco I puntava ora anche a conquistare il territorio del Ducato di Savoia.
Verso la fine di marzo 1536, l'esercito francese avanzò in Piemonte, riuscendo a conquistare Torino, ma fallì il tentativo di riprendere Milano. Vista la situazione nel nord d'Italia, Carlo V, tentò di convincere Papa Paolo III ad appoggiare la causa imperiale, ma il pontefice mantenne una posizione neutrale. Nonostante ciò, Carlo V invase la Francia in Provenza, tuttavia, non riuscì a proseguire l'avanzata poiché le forze francesi bloccarono tutte le vie di accesso , costringendo Carlo a ritirarsi. La fallimentare campagna in Provenza distolse l'attenzione di Carlo V dagli eventi in Italia e così le truppe francesi in Piemonte riuscirono a portare quasi tutto il Ducato di Savoia sotto il controllo di Francesco I.
Per contrastare Carlo V, Francesco I provò a realizzare un trattato di alleanza tra la Francia e il sultano dell'impero ottomano, Solimano il magnifico, per invadere l'Italia. Il trattato fu concluso all'inizio del 1536, facendo sì che, verso la fine di quell'anno, una flotta turca arrivò in prossimità delle coste di Genova, pronta ad attaccare in coordinamento con le forze terrestri che marciavano verso la città. Tuttavia, nell'agosto del 1536, le truppe ottomane trovarono Genova ben difesa, grazie ai recenti rinforzi, e una prevista insurrezione interna non si verificò. Sebbene l'intervento militare turco non si rivelasse decisivo, la loro presenza nel conflitto costrinse Carlo V a rivedere i suoi piani, trovandosi a dover affrontare la minaccia ottomana a est, mentre combatteva i francesi a ovest e gestiva la pressione dei principi luterani della Lega di Smalcalda all'interno del suo impero. Questa situazione spinse Carlo V a cercare un accordo di pace. La Tregua di Nizza, siglata il 18 giugno 1538 con Francesco I grazie alla mediazione di papa Paolo III, che sperava di unire le potenze cristiane contro i turchi, pose fine alle ostilità. La tregua lasciò i territori piemontesi occupati sotto controllo francese, senza apportare altri cambiamenti significativi tra gli Stati italiani.
Nel 1542, Francesco I di Francia ruppe la tregua di Nizza, stabilita qualche anno prima, riprendendo le ostilità. Alleatosi con il sultano ottomano Solimano il Magnifico, il sovrano francese lanciò una flotta congiunta franco-ottomana contro la città di Nizza, che fu conquistata il 22 agosto 1543. L'idea di un esercito cristiano e uno islamico uniti per attaccare una città cristiana sconvolse i contemporanei, ma ciò che destò ancor più scalpore fu la decisione di Francesco I di concedere il porto di Tolone alla flotta ottomana come base navale. Nonostante le vittorie francesi, l'avanzata di Francesco I verso la Lombardia fu nuovamente bloccata. Carlo V si alleandosi con Enrico VIII d'Inghilterra, e i loro eserciti invasero la Francia settentrionale, conquistando Boulogne e Soissons nel 1544. Tuttavia, la guerra proseguì nei Paesi Bassi e nelle province orientali della Francia, senza che si giungesse a una vittoria decisiva. La mancanza di coordinamento tra gli alleati e il peggioramento della situazione nel Mediterraneo, a causa dell'avanzata ottomana, spinsero Carlo V a cercare la fine delle ostilità e il ripristino dello status quo in Francia e Italia.
Nel 1544, le parti in conflitto concordarono di firmare la Pace di Crépy. Questo trattato assegnò la Lombardia definitivamente agli Asburgo e i territori del Ducato di Savoia alla Francia, ma non risolse le questioni fondamentali, lasciando aperta la possibilità di future guerre.
La morte di Francesco I nel 1547, dopo un regno durato oltre trent'anni, non segnò la fine del conflitto tra Francia e Asburgo, anzi fu causa di un'ulteriore ripresa. Infatti, la politica di opposizione all'Impero fu infatti proseguita dal nuovo re di Francia, Enrico II, che nel 1551 riprese le ostilità contro la dinastia d'Austria e la Spagna. Diversamente da suo padre, Enrico II concentrò i suoi sforzi sui confini nord-orientali della Francia, senza però trascurare l'Italia, che rimase un importante teatro di operazioni. Nonostante il titolo di “Re Cristianissimo”, Enrico II, come già suo padre, non esitò ad allearsi con protestanti tedeschi e musulmani turchi per indebolire i suoi avversari su più fronti.
A partire dal 1552, Enrico II invase la Lorena e occupò i vescovadi di Metz, Toul e Verdun, collegando astutamente questa fase delle guerre franco-asburgiche con il conflitto che, dal 1546, vedeva Carlo V impegnato contro i principi luterani tedeschi. Dopo tre anni di estenuante guerra di logoramento, la sovrapposizione dei conflitti e la pressione esercitata sia dall'esercito francese che da quello dei principi tedeschi costrinsero Carlo V a cercare la fine delle ostilità.
Nel 1555, con la pace di Augusta (mediata dal fratello Ferdinando e di grande rilievo anche sotto l'aspetto religioso), Carlo V raggiunse un accordo con i protestanti, mentre stipulò una tregua con Enrico II. Sorprendentemente, l'imperatore decise di ritirarsi dalla scena politica e militare europea, che aveva dominato per oltre trent'anni. Esausto dai continui impegni, Carlo V abdicò, cedendo i suoi domini al figlio Filippo II in Spagna, Italia, Paesi Bassi e nelle colonie extraeuropee, e al fratello Ferdinando I nel Sacro Romano Impero. Si ritirò quindi in un convento in Spagna, dove trascorse gli ultimi anni della sua vita in preghiera. Il conflitto però proseguì sotto i successori. Tra il 1557 e il 1559, ripresero le ostilità tra Enrico II, alleato con il nuovo papa Paolo IV, e Filippo II di Spagna. Emanuele Filiberto di Savoia, alla guida delle truppe spagnole, sconfisse definitivamente i francesi nella battaglia di San Quintino nel 1557. Tuttavia, gli elevati costi della guerra, aggravati dalle bancarotte che colpirono entrambi gli Stati, spinsero i contendenti a stipulare una pace più duratura rispetto alle precedenti. Così, nonostante la sconfitta, la Francia riuscì a mantenere il controllo delle tre importanti piazzeforti in Lorena, a recuperare Calais dagli inglesi e a conservare l'occupazione di Saluzzo in Piemonte con la pace di Cateau-Cambrésis.
La pace di Cateau-Cambrésis del 1559 pose fine a oltre sessant'anni di conflitti incessanti per il controllo dell'Italia e l'egemonia in Europa. Il 2 aprile, i delegati di Elisabetta I d'Inghilterra e di Enrico II di Francia firmarono l'accordo, seguito il giorno successivo da un trattato tra Enrico II e Filippo II di Spagna. Anche l'imperatore Ferdinando I d'Asburgo approvò la pace, sebbene non abbia siglato un trattato separato.
La pace di Cateau-Cambrésis segnò quindi la conclusione delle Guerre d'Italia e stabilì gli equilibri europei che sarebbero durati fino alla pace di Vestfalia del 1648, con gli Asburgo di Spagna e Austria come principali arbitri della politica continentale. Questo accordo ebbe un impatto significativo sulla storia d'Italia, poiché pose fine a conflitti che per quasi settant'anni avevano distrutto l'antico equilibrio e trasformato la penisola in un campo di battaglia per le potenze straniere. L'accordo consolidò definitivamente il dominio spagnolo in Italia, e, in particolare, gli Stati, del sud d'Italia, passarono a un ramo cadetto dei Borbone di Spagna dopo le guerre di successione austriache del XVIII secolo. In seguito alle stesse guerre, gli Asburgo-Lorena d'Austria ottennero il controllo diretto della Lombardia e della Toscana. L'assetto stabilito da Cateau-Cambrésis rimase dunque quasi invariato per 150 anni.